603.Устойчивость SARS-CoV-2

Устойчивость SARS-CoV-2 на окружающих поверхностях и в выделениях человека

Yongjian Liu*, Tianyi Li*, Yongqiang Deng*, Siyang Liu, Dong Zhang, Hanping Li, Xiaolin Wang, Lei Jia, Jingwan Han, Zhuchun Bei, Yusen Zhou, Lin Li#, Jingyun Li#

* Отмеченные авторы внесли равноценный вклад.

Главная государственная лаборатория патогенов и биологической безопасности, Пекинский институт микробиологии и эпидемиологии, Академия военно-медицинских наук, Пекин, Китайская народная республика

Сокращенный заголовок: Устойчивость SARS-CoV-2.

Автор, ответственный за переписку: Jingyun Li, PhD, Главная государственная лаборатория патогенов и биологической безопасности, Пекинский институт микробиологии и эпидемиологии, Академия военно-медицинских наук, 100071, Пекин, Китайская народная республика (эл. почта: lijyjk@163.com; телефон: +8610-63842689). Lin Li, PhD, Главная государственная лаборатория патогенов и биологической безопасности, Пекинский институт микробиологии и эпидемиологии, Академия военно-медицинских наук, 100071, Пекин, Китайская народная республика (эл. почта: dearwood2001@yahoo.com; телефон:+ 8610-63842689).

Резюме:

При комнатной температуре SARS-CoV-2 был устойчив на окружающих поверхностях и на гладких поверхностях сохранял жизнеспособность до 7 суток. Вирус был способен выживать несколько часов в кале и 3–4 суток в моче.

Ключевые слова: SARS-CoV-2; устойчивость, выживаемость

В конце 2019 года появился и быстро распространился по всему миру новый поражающий человека коронавирус 2-го типа, вызывающий тяжёлый острый респираторный синдром (SARS-CoV-2). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) назвала заболевание, вызываемое новым вирусом, коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19). По полученным ВОЗ сообщениям, на 5 мая 2020 года в мире было зарегистрировано 3 525 116 подтвержденных случаев COVID-19, в том числе 243 540 случаев, приведших к смерти. Вирус чрезвычайно контагиозен и отличается высоким риском передачи от человека к человеку, причем заражение часто происходит в лечебных учреждениях и в домашних условиях [1,2]. Информация о путях передачи вируса имеет первоочередное значение для профилактики инфекции SARS-CoV-2 и борьбы с эпидемией. Хотя основной путь передачи SARS-CoV-2 — воздушно-капельный — из дыхательных путей инфицированного пациента при близком контакте, передача вируса возможна и при прикосновении к контаминированным поверхностям. Если капли, выделяемые из дыхательных путей больного COVID-19, слишком велики, чтобы оставаться в воздухе в виде аэрозоля, они оседают на окружающие поверхности. Если прикоснуться к такой контаминированной поверхности, а затем дотронуться до глаз, носа или рта, можно заразиться COVID-19 [3]. Кроме того, доказанное поражение желудочно-кишечного тракта при инфекции SARS-CoV-2 и обнаружение РНК вируса в образцах кала заставляет задуматься о возможном фекально-оральном пути передачи этой инфекции [4,5]. В этой статье представлен отчет о результатах изучения устойчивости SARS-CoV-2 на различных поверхностях в окружающей среде и в выделениях человека (моче и кале). Данные по устойчивости SARS-COV-2 в различных условиях имеют большое значение для понимания путей передачи этого вируса.

МЕТОДЫ

Вирусные штаммы и клеточные линии

Первоначально штамм SARS-CoV-2, обозначенный BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020, был выделен из мазка, взятого из зева пациента с COVID-19. Как было описано ранее, в качестве субстрата для выращивания и титрования посевной культуры вируса использовали клетки линии Vero, которые культивировали в поддерживающей питательной среде DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), содержащей 2% сыворотки крови плодов крупного рогатого скота, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37 °C в атмосфере с 5% CO2.

Устойчивость SARS-CoV-2 на окружающих поверхностях

Для исследования были выбраны девять разнообразных объектов, представляющих возможные варианты поверхностей, встречающихся в домашних условиях и в больницах: нержавеющая сталь, пластик, стекло, керамика, бумага, хлопчатобумажная ткань, дерево, латексные перчатки и хирургическая маска. Все материалы разрезали на мелкие фрагменты с площадью примерно 1 × 1 см, промывали деионизированной водой и стерилизовали в автоклаве в течение 20 минут при температуре 121 ℃ (за исключением латексных перчаток). Фрагменты латексных перчаток для стерилизации помещали в 75% (о/о) этиловый спирт на 30 минут.

По 50 мкл посевной культуры вируса с инфекционным титром 106 ТЦД50/мл (ТЦД50 = 50%-ная тканевая цитопатогенная доза) (TCID50 – tissue culture infectious dose – доза цитопатогена (вируса) вызывающая цитопатический эффект в половине инфицированной культуры клеток – прим. ред.) наносили на каждую из исследуемых поверхностей и оставляли при комнатной температуре (25–27 °C) и относительной влажности 35%. Через заранее определенные промежутки времени (0 ч, 1 ч, 2 ч, 6 ч, 1 сут, 2 сут, 3 сут, 4 сут, 5 сут, 7 сут) к образцам добавляли по 500 мкл транспортной среды для восстановления жизнеспособности оставшихся вирусных частиц. Инфекционную активность остаточного вируса определяли титрованием в четырех параллелях на 96-луночных планшетах, в лунки которых помещали по 100 мкл культуры клеток Vero (2×10клеток/мл). Планшеты инкубировали в атмосфере с 5% CO2 при температуре 37 °C. На пятый день оценивали цитопатический эффект под микроскопом и определяли ТЦД50 для каждого образца в разных временных точках по методу Рида-Мюнха. Все эксперименты повторяли по три раза.

Устойчивость SARS-CoV-2 в кале и моче

Образцы кала и мочи были взяты у трех здоровых доноров, из которых трое были взрослыми и один семилетний ребенок. В описанном ранее порядке готовили 10% суспензию каждого образца кала в фосфатном буфере (pH 7,4) [6]. Суспензии кала и образцы мочи пропускали через фильтр с порами 0,2 мкм для удаления бактерий. В 2,7 мл каждой профильтрованной суспензии кала и каждого образца мочи вносили по 0,3 мл посевного материала вируса (106 ТЦД50/мл) и оставляли при комнатной температуре на 7 суток. Через заданные промежутки времени (0 ч, 1 ч, 2 ч, 6 ч, 1 сут, 2 сут, 3 сут, 4 сут, 5 сут, 7 сут) отбирали по 50 мкл от каждого образца и определяли титр вируса описанным выше методом.

Динамика гибели SARS-COV-2 в условиях эксперимента

Использовали метод двухфазной линейной регрессии для выявления зависимости логарифма ТЦД50/мл от времени и для оценки начального и конечного периодов полужизни вируса на основе метода определения периода полужизни для биологических объектов [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Устойчивость SARS-CoV-2 на окружающих поверхностях

Установлена устойчивость SARS-CoV-2 на пластике, нержавеющей стали, стекле, керамике, дереве, латексных перчатках и хирургических масках. На этих семи поверхностях вирус сохранял жизнеспособность в течение семи суток. Как показано на рисунке 1A, титры вируса на этих поверхностях медленно снижались. Например, значение ТЦД50/мл снижалось от 105,83 в начальный момент времени до 102,06 на 7сутки на пластике, что соответствует снижению вирусной нагрузки на 3,8 lg относительно исходной инокуляционной дозы. После 4 суток инкубирования на хлопчатобумажной ткани и после 5 суток инкубирования на бумаге инфекционно активный вирус выделить не удавалось (рисунок 1А). Через 1 час в условиях инкубирования наблюдалась быстрая потеря инфекционной активности вируса как на бумаге, так и на хлопчатобумажной ткани. От начального момента времени до истечения 1 часа титры вируса снижались от 105 до 103,28 ТЦД50/мл на хлопчатобумажной ткани и от 105,56 до 103,44 ТЦД50/мл на бумаге, что в среднем соответствовало снижению на 2 lg.

Устойчивость SARS-CoV-2 в кале и моче

Анализ всех трех образцов кала проводили при pH 7,5. На рисунке 1B показана динамика выживаемости SARS-CoV-2 в трех образцах кала. В первом образце кала взрослого человека жизнеспособный вирус не обнаруживался через 6 часов, а во втором жизнеспособных вирусных частиц не оставалось спустя 2 часа. Однако в образце кала ребенка вирус сохранял жизнеспособность в течение 2 суток, что, возможно, свидетельствует о более длительном выживании вируса в кале детей по сравнению с калом взрослых. В моче SARS-CoV-2 был устойчивее, чем в кале — инфекционно активный вирус обнаруживался в течение 3 суток в двух образцах, взятых у взрослых, и в течение 4 суток в моче ребенка.

Динамика гибели SARS-COV-2 в условиях эксперимента

Во всех условиях эксперимента, за исключением инкубирования на поверхности бумаги и в кале, кинетика гибели SARS-CoV-2 носила двухфазный характер. Значения начального периода полужизни SARS-CoV-2 находились в интервале от 0,17 до 0,9 ч, и в этой фазе наблюдалась быстрая потеря инфекционной активности. Однако конечный период полужизни SARS-CoV-2 в исследуемых образцах (среднее значение 19,2 ч) был продолжительнее начального (см. таблицу в дополнительных материалах). В конечной фазе титры вируса снижались медленно. Время выживания SARS-CoV-2 в кале был слишком малым, чтобы вычислить значение периода полужизни, а при инкубировании вируса на бумаге кинетика гибели вируса была однофазной.

ОБСУЖДЕНИЕ

Продолжающееся быстрое развитие пандемии COVID-19 говорит о наличии больших проблем с контролем этого заболевания и сдерживанием его распространения. Как следует из рекомендаций ВОЗ, источниками инфекции, участвующими в ее передаче, могут быть не только капли из дыхательных путей, но и контаминированные предметы и поверхности. В проведенном недавно исследовании получены доказательства высокого уровня контаминации поверхностей в местах нахождения пациентов с SARS-CoV-2, а значит, можно полагать, что в такой среде будет происходить передача инфекции [8]. В связи с этим необходимо срочно изучить устойчивость SARS-CoV-2 в различных условиях. В этом исследовании мы представили данные об устойчивости SARS-CoV-2 на девяти поверхностях окружающей среды, а также впервые полученные данные об устойчивости вируса в экскрементах человека (кале и моче).

До нашего исследования две группы исследователей опубликовали информацию об устойчивости SARS-CoV-2 на поверхностях из разных материалов. Результаты одного из этих исследований, опубликованные van Doremalen с соавторами, показали, что жизнеспособный вирус обнаруживается на поверхностях из пластика и нержавеющей стали в течение 2–3 суток [9]. В исследовании, проведенном д-ром Chin с коллегами, период сохранения жизнеспособности SARS-CoV-2 на разных поверхностях составлял от 2 до 7 суток в зависимости от гладкости поверхности [10]. В отличие от двух указанных выше исследований, наши данные говорят о более длительном выживании вируса на поверхностях в окружающей среде. Как правило, устойчивость вируса во внешней среде оценивали по результатам имитационных экспериментов, на которые влияли многие факторы. Конечные результаты зависели от титра вируса в посевном материале и объема инокулята. Мы использовали такой же объем инокулята, как в экспериментах ван Дормалена, но титр вируса в посевном материале у нас был на порядок выше. В исследовании Цзиня на изучаемые поверхности наносили по 5 мкл посевного материала с инфекционным титром вируса 106,8 ТЦД50/мл. В связи с этим мы настоятельно рекомендуем составить проект технической спецификации, которой можно будет руководствоваться при проведении дальнейших исследований выживаемости вновь выявляемых вирусов.

Возможность передачи SARS-CoV-2 через фомиты, в частности через экскременты человека, вызывает серьезную обеспокоенность общественности. В описаниях нескольких исследований сообщалось о присутствии РНК вируса в кале тех пациентов, у которых вирус перестал обнаруживаться в образцах из дыхательных путей [5, 11]. В этом исследовании мы показали, что рассматриваемый вирус остается жизнеспособным в течение нескольких часов в кале и в течение 3–4 часов в моче. Что касается выделения вируса, то получить его из образцов кала — непростая задача, несмотря на высокую концентрацию вирусной РНК. До недавнего времени из образцов кала были успешно выделены три штамма SARS-CoV-2 [12]. Непродолжительный период сохранения жизнеспособности SARS-CoV-2 в кале технически затрудняет выделение вируса из таких образцов. Стоит рекомендовать максимально сокращать время от сбора образца до выделения вируса. Пока мало фактических данных о присутствии РНК SARS-CoV-2 в моче, и на данный момент из образцов мочи не выделен инфекционно активный вирус. Однако имеются сообщения о выделении SARS-CoV, находящегося в близком родстве с SARS-CoV-2. С учетом всех этих данных передача SARS-CoV-2 через экскременты человека представляется весьма вероятной.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют об устойчивости SARS-CoV-2 на поверхностях в окружающей среде и их способности сохранять жизнеспособность в течение нескольких часов в кале и в течение 3–4 суток в моче. Для снижения риска передачи вируса рекомендуется эффективная гигиеническая обработка рук и дезинфекция туалетов.

Примечания

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и технологии Китайской народной республики (2020YFC0846200) и за счет гранта AWS19J003.

Заявление о доступности данных

Все данные, представленные в этой статье, и сведения о реактивах можно получить по запросу у авторов, ответственных за переписку.

Возможный конфликт интересов

Авторы статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Библиографические ссылки

  1. Chan JF-W, Yuan S, Kok K-H, et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. LANCET 2020; 395(10223): 514-23.
  2. Huang C, Wang Y, Li X, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. LANCET 2020; 395(10223): 497-506.
  3. Coronavirus disease (COVID-2019): situation report-66. Geneva: World Health Organization, 2020.
  4. Xiao F, Tang M, Zheng X, Liu Y, Li X, Shan H. Evidence for Gastrointestinal Infection of SARS-CoV-2. Gastroenterology 2020; (Epub ahead of print).
  5. Wu Y, Guo C, Tang L, et al. Prolonged presence of SARS-CoV-2 viral RNA in faecal samples. Lancet Gastroenterol Hepatol 2020; 5(5): 434-5.
  6. Lai MYY, Cheng PKC, Lim WWL. Survival of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Clin Infect Dis 2005; 41(7): e67-e71.
  7. Lee ML, Poon WY, Kingdon HS. A two-phase linear regression model for biologic half-life data. J Lab Clin Med 1990; 115(6): 745-8.
  8. Ong SWX, Tan YK, Chia PY, et al. Air, Surface Environmental, and Personal Protective Equipment Contamination by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) From a Symptomatic Patient. JAMA 2020; (Epub ahead of print).
  9. van Doremalen N, Bushmaker T, Morris DH, et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. N Engl J Med 2020: NEJMc2004973.
  10. Chin AWH, Chu JTS, Perera MRA, et al. Stability of SARS-CoV-2 in different environmental conditions. Lancet Microbe 2020; (Epub ahead of print).
  11. An T, Zhen-dong T, Hong-ling W, et al. Detection of Novel Coronavirus by RT-PCR in Stool Specimen from Asymptomatic Child, China. Emerg Infect Dis 2020; (Epub ahead of print).
  12. Yao H, Lu X, Chen Q, et al. Patient-derived mutations impact pathogenicity of SARS-CoV-2. medRxiv 2020: 2020.04.14.20060160.
Подписи к рисункам
Рисунок 1. Устойчивость SARS-CoV-2 на окружающих поверхностях и в экскрементах человека

(A) Продолжительность сохранения жизнеспособности SARS-CoV-2 на девяти поверхностях. Предел обнаружения используемого метода анализа составляет 101,5 ТЦД50/мл

(B) Продолжительность сохранения жизнеспособности SARS-CoV-2 в трех образцах кала и мочи. Предел обнаружения используемого метода анализа составляет 102,5 ТЦД50/мл из-за цитотоксичности, присущей образцам такого рода.

Устойчивость SARS-CoV-2 на различных поверхностях
Устойчивость SARS-CoV-2 на окружающих поверхностях и в экскрементах человека
Дополнительные материалы с сайта
Таблица. Периоды полужизни SARS-CoV-2 на различных поверхностях в окружающей среде

Материал

Начальный период полужизни (ч)

Скорректированный R2

Начальный период полужизни (ч)

Скорректированный R2

Пластик

0,57

0,99

16,38

0,95

Нержавеющая сталь

0,83

0,9

22,88

0,93

Стекло

0,84

0,9

22,3

0,87

Керамика

0,64

0,83

19,07

0,83

Хирургическая маска

0,51

0,89

21,71

0,61

Латексные перчатки

0,54

0,9

10,28

0,76

Хлопчатобумажная ткань

0,17

NaN

22,72

0,79

Дерево

0,2

NaN

21,41

0,72

Бумага#

4,75

0,14

4,75

0,14

Моча

0,9

NaN

16,38

0,92

NaN: не число; #Однофазная кинетика гибели вируса на бумаге

Рис. 2 Кинетика гибели SARS-CoV-2 в условиях эксперимента. Построение линейной регрессии для зависимости lg ТЦД50/мл от времени выполнено в программной среде R.
Устойчивость SARS-CoV-2
Кинетика гибели SARS-CoV-2 в условиях эксперимента. Построение линейной регрессии для зависимости lg ТЦД50/мл от времени выполнено в программной среде R.

 

Перевели Оксана Полякова, Полина, Ника Вечернина https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.05.07.20094805v1 https://doi.org/10.1101/2020.05.07.20094805

Оставить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *